Quina diferència hi ha entre un sistema PCR convencional i un sistema de PCR en temps real?


Resposta 1:

En poques paraules, el principi és el mateix: teniu dos primers (FW i RV). Estan dissenyats per a un objectiu específic o dissenyats per unir-se a diversos objectius però que tenen en comú una seqüència conservada.

Ara, en PCR en temps real, l’ús de primer es combina amb un colorant fluorescent que s’uneix dins d’un ADN de doble cadena (també conegut com agent intercalant, com SYBR Green) o amb sondes que porten amb elles un fluorocrom i un quencher. Tant l’enfocament (si cal conèixer-los en detalls t’ho explicaré, però aquí us adjunto a la pregunta principal) permeten controlar l’amplificació de la molècula d’ADN objectiu durant el pas d’amplificació, proporcionant a l’investigador una anàlisi quantitativa.

Per què és útil?

Què fa la PCR? Amplifica. Cada esdeveniment d’amplificació s’anomena cicle d’amplificació. Normalment els cercles d’amplificació es mantenen per sota dels 30 cicles per reacció (entre 25 i 28). Per què això? Perquè la PCR s’utilitza per veure si hi ha alguna cosa o no, o si hi ha alguna cosa en aquesta condició més o menys si es compara amb un control. Si els passos d’amplificació són massa, no podreu entendre si hi ha alguna cosa realment o si veieu un senyal només perquè deixeu que s’amplifiqui tantes vegades, de manera que al final sembla que hi hagi alguna cosa (ment. no dir "quantificar", perquè la PCR estàndard impossibilita fer-ho.

Per exemple, A era inferior a B. L’amplificació comença i després de 30 cicles s’executa un gel i A i B tenen un senyal fort. Així que dius "A = B, no hi ha diferència entre control i experiment". Això no hauria passat si haguéssiu fet només 25 cicles, per exemple, veieu què vull dir?

Mentre que amb PCR en temps real, podeu veure cicle per cicle quant d'amplificador (la cadena amplificada) en aquell moment durant aquest cicle específic. Així, si teniu 30 cicles quan obteniu el resultat, atenent al cicle d’amplificació anterior, podeu dir que “la diferència és real” o “no hi ha cap diferència”.

Això és realment el que funciona amb programari. Teniu llindar (així veureu el senyal; només si es troba per sobre d’una quantitat determinada, pot ser que l’escitista l’hagi establert segons la seva pròpia experiència de necessitat). I com podeu veure, a sobre del cicle 30, la figura comença a l'altiplà. Al moment, no serà possible distingir les coses, ja que semblaran iguals! Però, el programari us permet mirar tots els cicles i tenir una visió general del que ha passat cicle per cicle.

Espero que us ajudi, si necessiteu més detalls o aclariments, feu-me saber.


Resposta 2:

No ho vau preguntar, però vaig a remarcar que hi ha un altre esquema quantitatiu de PCR que creix en popularitat: la PCR digital.

La desavantatge de la PCR en temps real és que no podeu obtenir resultats realment quantitatius sense haver de reaccionar contra els estàndards. Una de les raons fonamentals d’això és que diferents amplicons mostraran diferents eficiències d’amplificació, que al seu torn poden ser influenciades per la variació de les condicions de reacció (com la no uniformitat del control de temperatura a la placa PCR) o els contaminants de la mostra. La PCR digital elimina aquests problemes convertint la PCR en un sistema binari: l'amplificació es veu o no es veu.

La PCR digital consisteix a executar moltes reaccions de PCR en paral·lel utilitzant el mateix material d’entrada. El truc és que la mostra es dilueix de manera que s’espera que moltes cambres de reacció no rebin molècules de plantilla. S'executa PCR i després es comptabilitza el nombre de cambres positives. Si es connecta a equacions basades en la distribució de Poisson, s'estima el nombre de molècules d'entrada. Com que es basa en el recompte, el nombre no depèn d'una corba estàndard; es pot limitar quantitatiu.

S'han comercialitzat diversos sistemes de PCR digitals, utilitzant pous o gotetes per a les cambres de reacció. També es diferencien pel nombre de cambres de PCR; els esquemes de gotes arriben a xifres molt més elevades. La precisió i l’interval dinàmic estan vinculats als números de gotes: amb més cambres podreu allunyar-vos en la vostra idea de concentració inicial.

Els diferents esquemes ofereixen diferents costos d’equips i facilitat el flux de treball. Per exemple, el dispositiu de Fluidigm està totalment integrat, però crec que és inferior a 1000 cambres per mostra, mentre que el sistema de BioRad compta amb etapes d’emulsificació, amplificació i recompte separades (amb dos dispositius dedicats; el termociclatge funciona en un termocicler estàndard) i desenes de milers de cambres.