Quina diferència hi ha entre els enzims CRISPR i els de restricció?


Resposta 1:

Tant els enzims de restricció com Cas9 (part del sistema CRISPR) són endonucleases, el que significa que tallen l'ADN en algun lloc al centre d'una cadena, en lloc de treure les bases del final. La diferència funcional principal es troba en el mecanisme pel qual reconeixen la seqüència que se suposa que tallaran.

La diferència més important és que, per als enzims de restricció, el lloc de tall està "cablejat" a l'estructura proteica. Un determinat enzim de restricció només es pot tallar en un lloc determinat. Per fer un enzim de restricció que reconegui un lloc nou caldria dissenyar una proteïna completament nova. Malauradament, en general, no sabem prou sobre com es pleguen les proteïnes per tal de dissenyar eficientment enzims nous.

Cas9, d’altra banda, està guiat al seu lloc tallat per un ARN guia únic (sgRNA) que dirigeix ​​de manera exclusiva la seqüència d’ADN a la qual és complementari. Això vol dir que, en lloc d’enginyar una proteïna completament nova, si volem orientar-nos a un lloc específic podem simplement canviar la seqüència d’argent, les tècniques per a les quals han estat pràctiques habituals durant les darreres dècades.

Hi ha algunes altres peculiaritats sobre cada sistema, però aquesta és la diferència fonamental entre tots dos, i per què CRISPR ha produït un salpicadíssim enorme. Antigament era extremadament difícil tallar l'ADN en una seqüència objectiu. Els enzims de restricció mai van ser realment una opció factible per a això, però es van desenvolupar tècniques per dissenyar endonucleases específiques (TALENs i ZFNs). Tot i això, requerien molt de temps i diners. Amb CRISPR, triguen uns dies.

EDIT: He oblidat esmentar que les ZFNs i TALEN (esmentades anteriorment) solen fer ús del domini de tall no específic de FokI, que és un enzim de restricció. Tot i això, el domini de reconeixement d'ADN no es basa en enzims de restricció.


Resposta 2:

A més de la resposta de Sudhakar, Cas9 també es pot utilitzar per als propòsits següents:

1. La substitució gènica, ja que les ruptures de doble fil produeixen poden induir la recombinació amb un tros d'ADN homòleg (però no necessàriament idèntic) introduït per l'experimentador.

2. Activació o inhibició de la transcripció de qualsevol gen - especificada per la seva vinculació a l'ARN guia - si es fusiona una versió catalitzadament inactiva amb un activador o repressor.


Resposta 3:

Bona pregunta, però bastant senzilla de respondre. Els enzims de restricció tenen una funció global en un tros d’ADN, tallaran aquest fil en llocs determinats, allà on i per molt que ho trobin. Així que, tot i que es poden definir els llocs en què es produirà, el procés de tall és incontrolable.

CRISPR, per la seva banda, es pot controlar de manera exquisida, ja que es guia per una peça única d’ARN, de manera que només tallarà allà on es trobi aquesta seqüència. Aquest sistema ha estat possible per no només retallar una sola parella de bases, sinó substituir-la per una altra.